時間年齢軸研究/In vivo イメージング

【時間年齢軸研究】

「生命は、個体の中で時間/年齢軸に沿って極めてダイナミックで精巧な制御のもとに生起する反応ネットワークの総体である」

我々は生体の時間/年齢軸の精巧な制御システムを明らかにし、一生の間(時間/年齢)で健康な体がいかに維持され、システムのどの箇所が一生のどの年齢で破綻した時に疾患が発症するか解明する研究を行っています

(ヒトの一生のメカニズムの解明)。


PI 浜田のこれまでの時間/年齢軸に関する研究

1. 九州大学薬学部  日本学術振興会特別研究員(大学院博士課程):

  哺乳類体内時計中枢 視交叉上核(SCN) の組織培養法を確立し、薬理学的手法をもちいてSCN単一神経放電リズム、2-DG取り込みリズムを計測。薬物がSCNに直接作用し位相変化するメカニズムに関する研究に従事。SCNの神経活動リズムを動かすには2つの経路があることを明らかにした。

(九州大学薬学部 渡辺繁紀教授・柴田重信教授の研究室での研究)


通商産業省 工業技術院 生命工学技術研究所 日本科学技術特別研究員

  体内時計中枢 SCN の光同調機構において光刺激を受けた視神経からglutamate が放出され SCN のglutamate 受容体活性化、そしてIP3 受容体の活性によるSCN 内カルシュウム  濃度変化の一連の過程が関与していることを明らかにした。

(通商産業省 工業技術院 生命工学技術研究所 石田直理雄博士の研究室での研究)


コロンビア大学 サイコロジーデパートメント 日本学術振興会海外特別研究員

  体内時計中枢 SCN には約1万個の神経細胞があるが、これまではSCN全ての神経細胞に時計遺伝子が発現あるいはサーカディアンリズムを持って発現すると考えられていた。浜田は、この常識を覆し SCN の全ての細胞に時計遺伝子が発現しないことを世界で初めて明らかにした。SCNでは時計遺伝子が発現している部位としていない部位が機能的に2つに分かれることで時計機構を形成していることを初めて明らかにした。

(コロンビア大学 日本学術振興会海外特別研究員 Rae Silver 博士の研究室での研究)


4. 早稲田大学  人間総合研究センタ- 助手:

  哺乳類体内時計中枢 視交叉上核(SCN) の活動周期を変化させる薬物の作用機序および活動周期24時間より長くした時に生物はどれくらいの環境変動周期に体のリズムを適応できるかの研究を行った。

(早稲田大学 人間総合研究センタ- 柴田重信教授の研究室での研究)


5.経済産業省 産業技術総合研究所 年齢軸生命工学研究センター 研究職員

  血液凝固第IX 因子 (FIX) の発現量は年齢とともに増加し,血栓誘発の危険因子の一つとして作用します。この現象を使い,一生涯にわたる体の恒常性機構を制御する蛋白質の同定に成功しました。同定した蛋白質は血液凝固活性が年齢とともに上昇する機構に重要であることを明らかとし、老化や年齢に伴う疾患研究に新しい道を開く蛋白質の同定に成功した。

(経済産業省 産業技術総合研究所 年齢軸生命工学研究センター 研究職員 倉知幸徳センター長、倉知須美子

健康インフォマティクスチーム長のもとでの研究)


6. 北海道大学医学研究科 光バイオイメージング部門 特任講師/ 特任准教授: 

  自由に動いているマウスの複数の遺伝子発現リズムを連続測定するシステムの開発に成功し、体内時計遺伝子による健康状態の可視化技術を可能とした。

(北海道大学医学研究科 光バイオイメージング部門 本間研一博士、本間さと博士、石川正純博士、白土博樹博士研究室での研究)


In vivo イメージング】       現在の多くのイメージング試薬は使えない!

                                                長期間の In vivo イメージング法の確立

 本研究室では主に自由に動いているマウスやラットの遺伝子発現を可視化あるいは定量化するためにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応(LL反応)を利用しています。LL反応で発せられる生物発光(bioluminecence) は非常に微弱で検出には超高感度カメラあるいは光電子増倍管(photonmultiplier tub: PMT) で検出します。蛍光(Fluorescence) と比較すると非常に暗く検出は難しいですが、LL反応は酵素反応であるため、励起光を必要とせずバックグランドが低く抑えられ、定量性にすぐれています。特にマウスやラットなどの個体をもちいた in vivo イメージングによる遺伝子発現の可視化・定量にはシグナルの特異性にすぐれています。蛍光をもちいた in vivo イメージングでは非特異的なシグナルが非常に多く検出され、マウスやラットが食べた餌も光ってしまいます。そこで生体内遺伝子発現は特異性が高い生物発光をもちい、シグナルが非常に強い蛍光は、シンチレーターなど人工的なものをマウスやラットにとりつけ位置マーカーとして使用することで、発光と蛍光のダブルレコーディングで自由に動いているマウスやラットの遺伝子発現追跡定量を可能にしております。


 体内時計研究では時計遺伝子の発現を長期間定量することが求められ、発現量に日内リズムが存在します。遺伝子発現が低い時ではバックグラント近くまで検出が落ちるときがあり、定量するにはバックグランドを低くすることが非常に大事になってきます。LL反応を利用したイメージングでは計測したい遺伝子にルシフェラーゼ遺伝子を連結したトランスジェニックマウスを作製することで遺伝子発現を可視化・定量することが可能になります。しかしながら シフェラーゼの基質であるルシフェリンを動物はつくれないため 体の外から投与しなければなりません。


    ここで一般的に問題になってくるのがルシフェリンのような基質の性質です。現在 生物発光を惹起するさまざまなルシフェラーゼ系酵素やその他の酵素蛋白質とその基質類が多くあります。本研究室では主にホタルルシフェラーゼとD-ルシフェリンカリウムをもちいた in vivo イメージングを行なっています。理由として長期間の in vivo イメージングにおいて生物発光強度が強く、安定しているためです。ホタルルシフェラーゼ・D-ルシフェリン系よりも発光強度が強いと市販されている試薬もさまざまありますが、長期間の遺伝子発現量の変化を調べるにはほとんど使い物になりません。D-ルシフェリンカリウムは水溶性であり、取扱いが簡単でありマウスやラットに投与するにあたり腹腔内投与や皮下投与で簡単に血液中に入り、全身にD-ルシフェリンが広がり、個体レベルの全身での遺伝子発現イメージングが可能になります。D-ルシフェリンカリウムとは違い脂溶性が高い基質は、長期間の in vivo イメージングではほとんど役に立ちません。全身に広がらないため個体レベルの全身で遺伝子発現イメージングができないためです。薬物の代謝を考えれば、水溶性薬物はスムーズに全身にひろがり、そして体外に排出されますが、脂溶性薬物は全身に広がらず、部位特異特異性もなく局所的にとどまり、水溶性薬物と比較し体外に排出されにくいため、発光シグナルの定量さえ問題になってきます。現段階では水溶性基質をもちいたin vivo イメージングが第一選択です。


 水溶性基質のルシフェリンを投与する方法も問題になります。腹腔内投与、皮下投与、静脈内投与するにあたり、長期間の連続投与しなければならず、一回の注射による投与法とは違います。現在 生物発光をもちいた in vivoイメージングでは 基質を一回の注射で体内に注入し、すぐにイメージングが行う方法が多く用いられてます。本研究室ではこの方法を用いておりません。なぜなら基質を注射で体内に注入した後 30分は非常に血中濃度が不安定で、あり指数関数的に血中濃度は減少していきます。その間の生物発光強度の変化量は桁違いに変化していきます。そして個体の計測部位においてもその変化は違います。本研究室ではマウス嗅球や大脳皮質におけるin vivoイメージングでは投与後30分は生物発光強度の変化量は不安定であり少なくとも投与後1時間でないと さまざまな処置による遺伝子発現定量の効果を調べるべきではないという結果を得ています。そこで血中基質濃度が安定して定常状態になるよう 薬物注入ポンプをもちいてマウスやラットに基質を長期間投与してin vivoイメージングを行なっております。ポンプには Alzet 社の浸透圧ポンプやプライムテック社のマイクロポンプなどがあり、それらをもちいて長期間血中濃度を安定化し自由行動しているマウスの時計遺伝子発現リズムを計測しております。ただしD-ルシフェリンカリウムが安定だとしても ポンプでもちいるのは1週間程度にしています。これはD-ルシフェリンカリウムが L-ルシフェリンカリウム(光学異性体)に1週間以上すると変化していく量が増え、生物発光に影響するからです。室温で黄色の溶液であるD-ルシフェリンカリウムを机の上に置いておくと、2週間もすると茶色に変化することからも明らかです。本研究室ではマウスにAlzet 社の浸透圧ポンプをもちいてD-ルシフェリンカリウムを2週間投与し、血中ルシフェリン量をHPLCで計測したところ L-ルシフェリンカリウムが劇的に増加しているのを確認しております。 L-ルシフェリンの問題点はD-ルシフェリンとルシフェラーゼによる生物発光反応を阻害し、遺伝子発現を示す生物発光強度が弱められるところにあります。

  

      以上、本研究室では長期間 生理学的条件化 自由に行動しているマウスの全身の遺伝子発現を可視化・定量するための発光基質投与方法を確立し、体表である嗅球や大脳皮質、小脳、皮膚だけでなく、脳深部や生体深部(癌組織など)や各臓器の遺伝子発現を長期間 定量する装置を開発しております。これらの薬物投与技術と計測機器による in vivoイメージングをもちいて 生命現象解明を目指し、研究を進めております。

時間軸研究

現在作成中

年齢軸研究

現在作成中